כשעלה קרול הראשון לשלטון ברומניה ב-1866 הוצגה חוקה חדשה שכללה סעיף בדבר זכות היהודים לאזרחות. סעיף זה בחוקה עורר הפגנות נגד ופרעות. בית הכנסת הגדול נפגע ונבזז, יהודים הותקפו וחנויותיהם נהרסו. בסופו של דבר הושמט הסעיף מן החוקה שהתקבלה, וביטלה למעשה את החוקים של הנסיך קוזה.
מעתה אפשר היה להתייחס אל היהודים כאל זרים, ולמנוע מהם את האזרחות הרומנית. כך פתח הממשל ברשות הנסיך קרול עידן חדש של אפליה משפטית לקהילה בת 165 אלף נפש, בני המעמד הבינוני, בעיקר בעלי מלאכה וסוחרים.
מ-1866 ועד מלחמת העצמאות ב-1877, רדפו השלטונות את היהודים בצורה שיטתית, באמצעות חוקים ותקנות מגבילות. שוב הוטלו הגבלות על זכותם להשתקע בכל מקום ולבחור מקצוע. הפעם היה זה שר הפנים יון ברטיאנו, מהפכן מ- 1848, שהנהיג מדיניות אנטי יהודית שיטתית ברוח חוקי התקנון האורגני. בשורת חוזרים שהופנו לראשי המחוזות באביב 1867 תבע לנקוט צעדים נמרצים כדי להיפטר מן "הנוודים". ברוח התקנון האורגני הוא קבע שהיהודים אינם רשאים עוד לגור באזורים כפריים, ולהחזיק באדמות או פונדקים באזורים כפריים; נאסרה עליהם חכירת אדמות חקלאיות, פעילות מקצועית במסגרת המדינה במקצועות הוראה, עריכת דין, רוקחות, רפואה, ועבודה ברשת הרכבות. חלה עליהם חובת השרות הצבאי, ללא אפשרות להגיע לקצונה.
ברומניה חיו באותה עת כמאתיים אלף יהודים, רובם במולדובה, והיוו גורם חשוב במרקם האוכלוסייה העירונית. ההוראות של ברטיאנו, שנועדו למעשה להביא לגרוש היהודים מהכפרים ומהמדינה, בוצעו באדיקות וביד קשה על ידי הכפופים לו.
בתקופה זו התרבו המחאות של אישים ומוסדות יהודיים במערב וכן של המעצמות, בלחץ אזרחיהן היהודים. משה מונטיפיורי, אז בן 83, נסע לבוקרשט במטרה לדרוש את הפסקת הרדיפות. ברטיאנו, נאלץ להתפטר 1868, אבל הגרושים המשיכו ואתם האווירה האנטי יהודית. 500 משפחות ממחוז באקאו גורשו בתוך 24 שעות. אליאנס פרסמה את הפרשה בעיתונות הפריזאית, Le Temps, La Patrie (13.14.4.1868 ) והנציגים הזרים בבוקרשט שלחו עצומה לראש הממשלה ב-15 לאפריל 1868. למרות כל אלה, במהלך 1869 המשיכו השלטונות את גרוש היהודים מהכפרים .חברת אלאיננס שבה והתערבה, וממשלת צרפת שלחה באמצעות הקונסול שלה בפריז מכתב אל שר החוץ התובע את הפסקת הגרושים.
בנוסף לכרמיה ומונטיפיורי, גם בנימין פרנקלין פישוטו שהתמנה לקונסול ארצות הברית ברומניה ב-1870 , נרתם למאבק למען האמנציפציה. במשך שש שנים עשה כל מאמץ כדי לשפר את מעמדם המשפטי של יהודי רומניה באמצעות פניות אל הנסיך קרול ושריו. כשהבין שלמרות המאמצים, אין סיכוי להשיג אמנציפציה ליהודי רומניה, הפך למצדד בהגירה מאסיבית לארצות הברית.
למרות מספרם השולי והעדר זכויות, הוכיחו היהודים במהלך מלחמת העצמאות את זיקתם לרומניה וגויסו לצבא הרומני כ 'תושבי הארץ.' סה"כ גויסו בשנים 1877- 1878, 888 חיילים מתוך 35 אלף הגייסות הלוחמים. בתום המלחמה קיוו היהודים שעתה יחול שינוי במצבם ויזכו באמנציפציה. אולם מפברואר 1878 כשהסתיימה המלחמה, ועד יוני 1878 כשנפתח קונגרס ברלין, לא עשתה ממשלת רומניה ולו צעד אחד בכיוון זה. היו אלה הארגונים היהודיים ובראשם אליאנס, שהחלו באותה עת בפעולה נרחבת למען האמנציפציה של יהודי רומניה.
בקונגרס ברלין שהתכנס ביוני 1878 ביוזמתו של ביסמרק ובמטרה ליצור שלום בר קיימא בבלקן, המעצמות הכירו בעצמאותה של רומניה, והיא חתמה על התחייבות להעניק זכויות אזרח ליהודים ולהסיר את ההגבלות הכלכליות שהוטלו עליהם, אולם לא כיבדה אותה. אמנת ברלין נחתמה ב-13 ביולי 1878 בהבטחת האמנציפציה ליהודי רומניה בסעיפים 43 ו 44 .